1 實驗部分
1.1 試劑與儀器
蘿卜紅色素; 天竺葵232O2葡萄糖苷標準品(純度大于97% , Sigma公司) ; 甲醇、乙腈(色譜純) ; 甲酸(分析純) ; 超純水(電阻率1812 MΩ ·cm) 。液相色譜儀(UV檢測器)
1.2 色譜條件
液相色譜柱: Ultimate XB2C18色譜柱(416 mm ×250 mm ×5μm) ; 流動相: 乙腈- 5%甲酸溶液(體積比24 ∶76) ; 流速: 110 mL /min; 柱溫: 25 ℃; 進樣量: 10μL; 紫外檢測波長: 525 nm。
1.3 標準品與樣品溶液的制備
稱取天竺葵232O2葡萄糖苷標準品510 mg, 用甲醇溶解并定容于5 mL容量瓶中, 得110 g/L標準品儲備液, 低溫保存, 備用。取一定量蘿卜紅色素樣品, 用甲醇溶解并定容于10 mL 容量瓶中, 得待測樣品溶液, 低溫保存,備用。
1.4 測定方法
分別吸取0105、011、012、015、110 mL天竺葵232O2葡萄糖苷標準品儲備液, 用甲醇定容于5 mL容量瓶中配成系列不同質量濃度的標準溶液, 在優化測定條件下進行色譜分析, 根據峰面積繪制標準曲線。樣品測定: 取經0145μm微孔膜過濾的蘿卜紅色素溶液10μL, 注入液相色譜儀, 比較樣品與標準品的液相色譜圖, 根據組分保留時間進行定性分析, 與標準樣品的峰面積及標準工作曲線比較進行定量分析。
2 結果與討論
2.1 色譜條件的選擇
采用多組洗脫溶劑體系(乙腈- 甲醇、乙腈- 水、甲醇- 水)分離樣品, 并考察了pH值對樣品分離度的影響。由于天竺葵232O2葡萄糖苷中的酚羥基在水溶液中易發生電離, 極性增強, 在固定相表面形成雙重保留機理, 色譜峰拖尾嚴重, 定量分析誤差較大。因此選擇在流動相中加入甲酸調節pH 值。當甲酸體積分數為10%、9%、7%、5%、3%時, 天竺葵232O2葡萄糖苷色譜峰對應的保留時間分別為2132、2167、2197、3160、4191 min。結合峰形和保留時間, 確定甲酸體積分數為5% , 此時流動相的pH值不小于3。在此色譜條件下, 可以明顯改善色譜峰的峰形。
以乙腈- 甲醇為流動相, 在不加酸的情況下, 色譜峰較寬, 樣品未*分離導致保留時間較短且峰形不佳。流動相為甲醇- 水時, 甲醇的洗脫能力不強, 保留時間延長,天竺葵232O2葡萄糖苷與其他組分的峰重疊, 分離效果差,峰形不對稱, 基線明顯漂移。流動相為乙腈- 水時, 隨著流動相中甲酸水溶液比例的增加, 天竺葵232O2葡萄糖苷峰拖尾和峰形不對稱問題得到改善, 可獲得理想的保留時間和分離效果。結果表明: 以乙腈- 5%甲酸溶液(24 ∶76) 為流動相獲得了較優的色譜分離效果。
圖1為優化條件下, 天竺葵232O2葡萄糖苷標樣及蘿卜紅色素樣品的液相色譜圖。
2.2 線性方程、線性范圍及檢出限
在優化條件下測定對照品系列標準溶液, 以峰面積Y為縱坐標, 質量濃度X ( g/L)為橫坐標, 計算標準曲線方程、線性范圍和檢出限。線性回歸方程為Y = 8161 ×10- 8 X - 01004 8, 相關系數r = 01999。實驗表明, 天竺葵232O2葡萄糖苷在0101～0110 g/L范圍內呈良好的線性關系。將標準溶液逐級稀釋進樣, 測其峰高響應值及基線噪音強度, 以3倍信噪比計算檢出限為01002 5 g/L。
213 方法回收率、精密度及穩定性
吸取已知含量的蘿卜紅色素樣品溶液, 加入一定量的標準對照品溶液進行測定, 回收率見表1。平均加標回收率為97%～100% , 相對標準偏差為112% ( n = 6) , 方法的準確度和精密度均可滿足測定要求。
取相同的蘿卜紅色素樣品溶液在“112”條件下進樣10μL, 每2 h進樣1次, 共進樣5次, 測得天竺葵232O2葡萄糖苷的含量逐漸下降。其原因主要是由于蘿卜紅色素樣品溶液暴露在室溫條件下, 天竺葵232O2葡萄糖苷被氧化造成其含量逐漸減少[ 14 - 15 ] 。因此, 在花色苷的檢測過程中, 應盡量保證天竺葵232O2葡萄糖苷標準溶液與待測樣品溶液現做現配, 并在低于- 16 ℃條件下保存。
3 結 論
本文建立了蘿卜紅色素中天竺葵232O2葡萄糖苷含量的液相色譜檢測方法。通過對實驗條件的優化, 確定了色譜條件。測定結果表明, 該方法的靈敏度和度可以滿足實際樣品檢測需要, 適用于蘿卜紅色素中花色苷含量的測定。
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