產品名稱:第1鏈cDNA合成試劑盒
英文名稱:RT EasyTM(For first-strand cDNA synthesis)
產品規格:25 rxns 100 rxns
產品貨號:RT-01011
保存說明:短期室溫，*2-8℃
產品描述:用于長cDNA合成或者客戶特定引物RT反應
英文名稱:RT EasyTM(First-strand cDNA for Real Time PCR)
產品規格:50 rxns 200 rxns
產品貨號:RT-01021
產品描述:第1鏈合成，添加2種引物，用于Real Time PCR
第1鏈cDNA合成試劑盒注意事項:
1、確保RNA完整性及純度。RNA質量是決定合成cDNA第1鏈成功的關鍵因素,其純度及完整性可由OD260/OD280比值和進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。較純的RNA樣品OD260/OD280比值通常為1.8-2.0,若該比值偏低,應進一步純化。真核生物RNA樣品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1,否則,表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。進行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須*無菌。操作過程始終戴手套以杜絕各種RNA酶的污染。
3、 合成cDNA第1鏈的引物選擇。選擇oligo(dT)12-18作為反轉錄引物,可保證cDNA具有完整的3’-端,通常可得到接近全長的cDNA第1鏈;若選擇隨機寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物,引物在整個mRNA的多個位點退火,產生短的部分長度的cDNA第1鏈。這種方法經常用于獲得5’末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。
第1鏈cDNA合成試劑盒操作方法:
1、 逆轉錄反應
(1) 在無菌薄壁管中加入以下成份:
Total RNA 0.5-1.0µg
(dN)9 or oligo(dT)18 100pmol
(2) 混勻后,70℃變性5min,將薄壁管迅速置于冰上冷卻,然后依次加入以下成份:
5×M-MLV Buffer 4µl
dNTPs(10mM each) 1µl
RNasin 10U
100mM DTT 2µl
M-MLV Reverse Transcriptase 100U
DEPC-treated water up to 20µl
(3) 混勻后短暫離心，使用oligo(dT)18引物時在42℃，使用隨機引物(dN)9時在37℃下溫育1小時。
(4) 94℃ 5min終止反應后,冰上冷卻。
(5) 合成的cDNA第1鏈可直接用于PCR擴增或進行其它下游操作。
